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实时荧光定量PCR的优化（一）

发布时间： 2021-10-12　　点击次数： 2271次

如果是病毒定量和SNP基因分型的实时荧光定量PCR，我们需要尽可能高特异性；如果是病原体、mRNA检测，我们需要高灵敏度。

想要提高PCR扩增效率、特异性及灵敏度，我们可以通过一系列措施优化实时荧光定量PCR实验。首先是靶序列的选择。

1、选择的靶序列合适长度在50～150bp之间。较短的序列合成耗时短，扩增时间缩短，因此污染DNA被扩增的可能性降低。

2、选择靶序列时，使用BLAST检索分析靶序列是否存在多态性和测序错误，并避开。如果靶序列中出现重复序列，会降低PCR检测灵敏度，也应该避开。

3、控制靶序列中GC含量≤60%。高GC含量，会影响靶序列在热循环中的变性，也容易产生非特异性扩增。

4、避免产生二级结构。靶序列如果有反向重复的序列，容易产生二级结构，影响引物、探针的杂交。

除此以外，我们还需要保证模板的质量不会影响扩增，实时荧光PCR的结果才有可靠性。例如损伤的DNA在PCR中不能充分扩增，或者根本不能扩增。同时，如果模板中存在抑制DNA聚合酶的试剂（DMSO等）和污染物（SDS等），也会影响PCR的可靠性。

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