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实时荧光定量PCR的优化（四）
发布时间： 2021-10-12 点击次数： 1728次这期我们来学习设计TaqMan探针，应该考虑的因素有以下这些......
1、TaqMan探针的最佳长度在20bp，不超过30bp，这样才能实现荧光淬灭。有些情况下超过30bp也是可以的，需要将淬灭基团设计在距离5'端18～25bp的地方。
2、TaqMan探针的Tm值要比引物的高10°C，通常在65～70°C之间，确保探针比引物先结合在模板上。
3、探针序列应该避免连续的单碱基重复序列，尤其是G，因为这可能影响探针的二级结构，降低杂交效率。
只能使用这种单碱基重复序列时，可通过肌苷替代鸟嘌呤，中断连续。
如果是5'端有太多鸟嘌呤，也会产生不好影响，淬灭探针的荧光。
4、TaqMan探针的GC含量应该在50%。
5、探针5'端应该尽可能与3'端相似，保证Taq酶快速降解探针。
6、制备好的探针应采用HPLC纯化
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