实时荧光定量PCR的优化（六）

引物和探针的浓度也需要寻找*浓度，这通常凭借经验决定。

为什么要寻找*浓度呢？

因为像Taqman探针在反应过程中会被破坏，需要在起始浓度便保留足量的探针。这个浓度通常是在反应体系中达到250nmol/L。但我们不能无限制的添加探针，这会增加成本，尤其是大批量检测时，我们需要减少生产试剂的成本。

实际探索优化中，对Taqman探针法为原理的实时荧光定量PCR实验，我们也可以使用SYBR Green I法对引物浓度进行测试，因为SYBR  Green I染料能与任意双链DNA结合，可以检测到产生的引物二聚体和其他非特异性扩增产物的量。引物二聚体会降低扩增效率和特异性，我们希望找到合适的引物浓度，减少二聚体、非特异性产物的产生。

综上，我们需要寻找引物和探针的*浓度，保证反应的灵敏度的同时，降低成本，并获得最大特异性。

在实践中，我们通常推荐这样的方法来进行优化：

1、优化引物浓度时从一个标准的浓度开始优化，每次调整浓度后制作标准曲线图，通过分析标准曲线图判断优化效果。推荐的标准优化浓度：Taqman探针法终浓度是500nmol/L，SYBR Green I法是200～400nmol/L。

2、引物浓度效果评判的标准：标准曲线是线性的，且效率>80%，可以认为浓度是合适的，就不需要进一步优化了。