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NGS建库人都在用的文库质量评定方法，你都知道吗？

发布时间： 2021-10-25　　点击次数： 3093次

高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）近年来飞速发展，在各个领域已被广泛应用。而文库的制备是NGS技术中极为重要的步骤。所谓文库制备（Library Preparation）就是在DNA的片段两端连接上特定序列的接头的过程，让文库可以在高通量测序平台上进行测序。

文库构建的最终目的在于成功测序，并获得序列信息。那么如何判定这个文库能否上机测序呢？想必这是大家一致关注的问题。

文库的数量和质量是能否成功测序的关键。文库的浓度和文库分布是评价文库质量的两个关键参数。

文库浓度测定

文库构建完成后，我们首*行文库浓度的测定。核酸定量的方式有多种，但基于紫外分光光度的测定方法相对不够精准定量，比如Nanodrop或酶标仪，我们推荐使用染料法进行核酸定量，在文库构建中比较常用的核酸定量仪器是Thermo Life Qubit 3.0荧光定量仪。

文库分布检测
如果文库浓度符合上机需求，接下来我们用Agilent 2100生物分析仪来检测其片段大小是否符合预期，其峰值大小应该是目的片段加上接头序列的总长度。
除ATAC、cfDNA和small RNA等特殊文库外，一般情况下，好的文库应该呈现出单一的、圆滑的峰且接近正态分布，并且文库中小于280 bp和大于1000 bp的片段占比不要过大（如大于20%）都可上机测序。
图1：常规文库2100峰型图
图2：cfDNA文库2100峰型图
图3：ATAC文库2100峰型图

常见问题和解决方案

Q1
文库峰型偏大
A1

这种情况出现可能因一轮分选方案中磁珠用量过少，导致大片段残留过多。为保证文库主峰在合格上机范围内，可增加分选方案中一轮磁珠用量来解决。
图4：文库峰型偏大

Q2
在150 bp以下出现杂峰
A2

这种情况可能是因为引物二聚体或者接头二聚体的出现所致，一般引物二聚体的长度在100 bp以下，接头二聚体的长度在125 bp左右。为保证测序数据的质量，可以通过减少引物使用量、连接反应前稀释接头，降低磁珠的比例对文库进行再一次纯化来解决。
图5：接头、引物残留峰型图
（红色箭头标注为引物残留，蓝色箭头标注为接头残留）

Q3
upper marker出现翘尾
A3

高产量文库通常会出现不同程度的过度扩增现象。因为在文库扩增后期，通常引物被最先耗尽，大量文库片段在无法结合到引物的情况下，片段之间通过不*匹配关系退火结合，从而形成部分双链+部分单链的杂合链，且片段更大。根据不同检测方式的对应原理，过度扩增产物在Agilent 2100 生物分析仪峰型中表现为upper marker之后有轻微翘尾；但以上现象均属正常，不影响文库测序和数据分析。
图9：过度扩增峰型图
通过以上介绍，小伙伴们是不是对文库质量评定一目了然了呢？那就赶紧动手吧！

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