氨甲喋呤抗性和DHFR扩增实验方法

1. 克隆培养亲代细胞形成生长旺盛、基因型一致的细胞群体，用于筛选。

2. 用无菌 NaCl 0.15 mol/L ( 0.85 % ) 稀释 MTX，临床使用的包装是浓度为 2.5 mg/ml 的溶液。

3. 在几个相同的培养瓶中分别种 2.5×105 个细胞，每个培养瓶中加入不含 MTX 或含 0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.05 μg/ml 和 0.1 μg/ml MTX 的*培养基，将培养基的 pH 调至 7.4，37°C 培养 5~7 天。

4. 在倒置显微镜下观察细胞，如果培养瓶中出现有一小部分细胞克隆生长，其余的一些细胞是变大的，附着在基质层上的可能要死的细胞，选择这种培养瓶的细胞，换含有相同量 MTX 的新鲜培养基继续培养。

5. 如果需要，可以更换新鲜培养基，再培养 5~7 天，但是细胞必须始终处于 MTX 环境中。当细胞密度达到 2~10×106 个/瓶，将细胞以每瓶 2.5×105 个传入新培养瓶，分别加人原浓度的 MTX 和 2~10 倍原浓度的 MTX 。

6. 5~7 天后观察新传代的和原来加入较高浓度 MTX 的细胞，更换培养基，选择可用细胞，方法同前。

7. 每步传代的细胞用逐步增高的药物浓度持续筛选，直至获得要求的耐药水平。改变而获得低到中等水平耐药、DHFR 活性增加和（或）转运能力改变的中同仓鼠细胞需要 2~3 个月；对于中国仓鼠细胞、小鼠细胞或生长快的人的细胞来说，获得高水平耐药性和酶过度产生的变异株需要 4~6 个月或更长时间。

8. 定期冻存筛选中的细胞于液氮中。