传代细胞培养实验操作步骤

一、贴壁细胞：HeLa细胞的传代培养

1. 选取生长密度80%左右的HeLa细胞，在生物安全柜中操作，吸去培养皿中的旧培养基，加入2 mL的D-Hanks溶液，漂洗细胞以除去残留的血清。

2. 吸去培养皿中的D-Hanks溶液，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，于37℃消化2～3 min(如消化程度不够，可延长时间)，倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆时，轻轻吸去酶消化液（如果有较多细胞漂起，需要直接加入*培养基来终止胰蛋白酶的消化反应）。

3. 加入4 mL*培养基，用移液管反复吹打细胞成为细胞悬液。将细胞悬液转移到15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。

4. 轻轻吸去上清后用*培养基重悬细胞，把细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。

5. 接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、本次传代日期和操作人，轻轻摇匀后转移到CO2培养箱中于37℃培养。

6. 细胞培养24 h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理）。

二、悬浮细胞或半贴壁细胞的传代培养

悬浮细胞不贴壁（半贴壁细胞贴壁不紧），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具体过程如下：

1. 取状态良好的细胞，在生物安全柜中操作，用移液管把细胞吹打均匀。

2. 把细胞悬液转移到15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。

3. 轻轻吸去上清后用*培养基重悬细胞，把细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。

4. 接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、本次传代日期和操作人．轻轻摇匀后转移到CO2培养箱中于37℃培养。

5. 细胞培养24 h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理）。