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如何从组织中分离制备细胞核基质/中间纤维支架结构？

发布时间： 2021-11-18　　点击次数： 1204次

材料与仪器
新鲜组织
NaCl 缓冲液细胞骨架缓冲液
Teflon 研杵 Doume 匀浆器
步骤
1. 在 4℃ 将新鲜组织切成 1 mm3 左右的小块。在 4℃，用 Teflon 研杵和 Doume 匀浆器在含 0.5% Tritron X-100 的细胞骨架缓冲液中对切碎的组织进行匀浆，直到没有可见的团块。每克组织用大约 10 ml 缓冲液。

含 0.5% Triton X-100 的细胞骨架缓冲液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

300 mmoI/L 蔗糖

100 mmoI/L NaCI

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EGTA

2. 用一 250 μm 孔径的尼龙滤器过滤匀浆。基质成分和没有充分匀浆的团块将留在滤器上。

3. 在 4℃ 用抽提缓冲液抽提 3~5 分钟。

抽提缓冲液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

250 mmol/L 硫酸铵

300 mmol/L 蔗糖

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EGTA

4. 在含 0.5% Triion X-I00 的消化缓冲液中用无 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色质 DNA 酶浓度为 200~400 单位/ml，32℃ 反应 30~50 分钟。

含 0.5 % Triton X-100 的消化缓冲液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

300 mmol/L 蔗糖

50 mmol/L NaCl

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EGTA

5. 用抽提缓冲液清洗样品 5 分钟。

6. （可选）样品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分钟。这一步能使可能形成核基质核心的 10 nm纤丝分支显形（Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ（每种酶400 单位/ml）代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纤丝保存的更好。

2 mol/L NaCl 缓冲液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

300 mmol/L 蔗糖

2 mol/L NaCl

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EGTA

7. 固定核基质以进行免疫荧光检测或电子显微镜检测。

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