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从培养的细胞中纯化总RNA的方法

发布时间： 2021-11-24　　点击次数： 1321次

材料与仪器
细胞
RNA 提取缓冲液变性液水饱和酚
培养皿 Falcon 2063 管
步骤
1. 取 1 个细胞已长满的 100 ml 培养皿，吸出培养液，加 2 ml RNA 提取缓冲液，用橡胶刮棒刮下细胞。

RNA 提取缓冲液：

变性液，20 ml

β-巯基乙醇，0.144 ml

2 mol/L 乙酸钠，pH 4，2 ml

水饱和酚，22 ml

可避光保存在 4℃ 2~3 个月。

变性液：

4 mol/L 硫氰酸胍：250 g 硫氰酸胍

25 mmol/L 柠檬酸钠：17.6 ml 0.75 mol/L 柠檬酸钠，pH 7

0.5% 十二烷基肌氨酸钠（Sarkoayl）：26.4 ml 10% 十二烷基肌氨酸钠，293 ml H2O

混合各组分，在 65℃ 搅拌溶解。可以在室温保存 3 个月。

水饱和酚：

用在水浴中加热到 65℃ 的灭菌水来溶解酚。从水浴取出后使冷却到 4℃。加足量水以维持水相（上相）。可在 4℃ 避光保存 2~3 个月。

2. 细胞裂解物转移到一个 Falcon 2063 管中，加 200 μl 氯仿，混合均匀。

3. 细胞冰浴 15 分钟。

4. 细胞裂解物在 4℃ 以 5000 g 离心 30 分钟。

5. 转移水（上）相，注意不要搅动交界面，水相放到一个干净的 Falcon 2063 管中并加入 1 ml 异丙醇（仅用于 RNA 工作的溶液）。

6. 管子在 -20℃ 放至少 1 小时或过夜。

7. 用固定角度的转头在 4℃ 以 8000 g 离心 30 分钟沉淀 RNA，小心去掉上清。

8. 加 1 ml 70% 乙醇洗白色沉淀物并在以 8000 g 离心 15 分钟。洗 3 次，不要振摇。

9. 最后一次 70% 乙醇洗涤后，去掉乙醇并稍稍离心管子收集残液。吸掉剩下的乙醇。

10. 短时间干燥沉淀。空气干燥约 30 分钟或在真空干燥器中 2~3 分钟。

11. 用 50~100 μl DEPC 处理过的水重悬 RNA，测量 1:100 稀释的样品的光密度（OD260）来计算浓度。

浓度（μg/ml）=（稀释度）[（40 μg/ml·OD260）]（样品的 OD260）

12. 重悬的 RNA 贮存在 -70℃。

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