实时荧光定量 PCR 操作流程及注意事项---FAQ

FAQ

总RNA提取-酚氯仿抽提法

RNA降解

组织样本保存不当。RNA提取时需选择新鲜组织或细胞样本，若为冻存样本，尽量避免反复冻融。样品离开活体或原来的生长环境后，样品中的内源 RNase开始降解 RNA，降解速度与内源 RNase 的含量及温度有关。 也可将新鲜组织充分浸泡在 RNA Keeper Tissue Stabilizer (Vazyme #R501) 中，组织可于室温存放一周，4℃存放一个月 或 -20℃ /-80℃长期保存。 投入样本较多，导致裂解不充分。RNA保存时间过久，发生降解。对提取的 RNA 进行纯度和完整度检测，分管于 -80℃长期保存或于 -20℃短期保存，尽快使用，避免反复冻融。

提取的RNA有基因组污染

向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下 (2℃ -8℃ ) 高速离心。 离心后，RNA 被抽提到上层的水相中，中、下层为有机相，含有氯仿。DNA 即存在于中层。氯仿在常温下会与水以一定的比例互溶，因此，常温离心会导致上层水相中也有少量基因组 DNA 污染。另外，吸取上层液体时，应非常小心，避免吸到中间层和下层。

加入异丙醇离心后未看到沉淀

RNA 含量可能较低。建议加入异丙醇后于 4℃或 -20℃放置 10-30 min 后再次离心。若依然看不到沉淀，弃上清时，采用吸取而非倾倒的方法，以免沉淀丢失。

总RNA提取-柱式提取法

gDNA-Filter Columns 堵塞问题

（a）样品用量太多

本试剂盒适用于提取 10-20 mg 动物组织或者 2-5×106 个细胞，超量的组织会降低产量以及纯度，操作时应减少样本使用量。

（b）样品富含肌纤维

肌肉、心脏以及皮肤等富含肌纤维，肌纤维的分子量大，会引起柱子堵塞，样本处理时采用液氮研磨方式会降低堵柱现象。

(c) 组织研磨或者匀浆不充分

研磨或者匀浆不充分时，碎片有可能导致柱堵塞，将裂解后的液体先进行 13,000 × g 离心 5 min，取上清再加入 gDNAFilter Columns。

提取不到RNA或者RNA产量低

（a）样本保存不当或者样本保存时间过久

样本保存不当或者保存时间过长都有可能导致 RNA 的降解，采集新鲜样本或经过液氮速冻后保存于 -70℃或液氮中的样本。

(b)匀浆或者液氮研磨不充分

匀浆或者液氮研磨不充分，裂解不充分，导致 RNA 的释放不充分。

(c)洗脱不充分

RNase-free ddH2O 滴加到纯化柱膜中央。纯化柱的洗脱体积为 50-200 μl，若洗脱效果不理想，可加入提前于 65℃预热的 RNase-free ddH2O，延长室温放置时间，离心后进行第二次洗脱。

RNA 降解

纯化后的 RNA降解与样本质量、是否被 RNase 污染、操作方式等因素有关：

（a）样本因为没有及时保存，导致 RNA 降解

组织样本或者细胞在收集后若不及时进行后续实验，液氮速冻后于 -70℃保存。

（b）样本反复冻融

组织样本保存时，分小块保存，避免因反复冻融导致样本降解。

（c）电泳原因

RNA 降解现象部分因电泳过程引起，电泳前将电泳槽用 3％双氧水浸泡 20 min，之后用 RNase-free ddH2O 进行冲洗，电 泳缓冲液用 RNase-free ddH2O 配置。

(d)确保提取过程中使用的枪头和离心管均为 RNase-free。

下游实验结果不理想

（a）洗脱后 RNA 中有盐离子残留

纯化柱需要进行两次 Buffer RW2 洗涤，如果两次洗涤后仍存在盐离子残留，则在加入 Buffer RW2 后，室温放置 5 min 再 进行离心操作，以最高水准上去除盐离子污染。

(b)洗脱后 RNA 有乙醇残留

确认 Buffer RW2 洗涤后，按操作说明所需的离心转速进行空管离心操作；如仍有乙醇残留，可在空管离心后室温放置  5 min，最高水准上去除残留乙醇。

式抽提法

提取的RNA有基因组DNA污染

不同种类组织细胞 DNA、RNA 含量相差较大，样本上样量请勿超过 20 mg 组织和 5×106 细胞。如肝脏、脾脏和肾脏 DNA 含量丰富，上样量请勿超过 10 mg，否则会导致基因组残留过多。gDNA-Filter Columns 能够有效去除体系中大部分 DNA，如果下游实验对痕量 DNA 敏感，可根据具体情况选择使用以下方案：

(a) 使用试剂盒提供的 DNase I 工作液进行膜上消化清除残留 DNA，具体过程请参照实验操作流程模块。

(b)逆转录时选择含有基因组去除模块的逆转录试剂，推荐使用 HiScript®  III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)  (Vazyme #R323)。

(c)设计引物时选用跨内含子的引物，从而避免基因组 DNA 模板参与扩增反应。

逆转录反应

逆转录试剂盒中带有gDNA wiper Mix，可以去除残留在RNA中的基因组。但如果不进行基因组去除，会影响接下来的逆转录吗？

不去除基因组并不会影响逆转录实验的进行，但如果基因组残留严重而未进行去除，会影响下游荧光定量实验的准确性。

延长逆转录时间，是否可以提高逆转录效率？

对于一般体系，延长逆转录时间对逆转录效率并没有显著提升；对于一些 GC 含量较高或含高级结构的模板，延长逆转录 时间可提升逆转录效率。

荧光定量PCR

绝对定量标准曲线线性关系不佳

(a)加样误差

加大模板稀释倍数，提高加样体积。

(b)标准品降解

重新制备标准品，重复实验。

(c)模板浓度过高

增加模板稀释倍数。

在定量时，如何判断cDNA投入量

第一次得到的 cDNA 需要进行多个梯度稀释，将不同梯度稀释的 cDNA 进行 qPCR 定量，选取 CT 值落在 18-28，或者 15-33 范围内的扩增曲线对应的 cDNA 稀释梯度作为后续该基因的参考稀释度。(CT 值在 18-28，或者 15-33 区间范围被认为是 准确的 )。

融解曲线多峰

（a）引物设计不优：根据设计原则设计合成新的引物。

（b）引物浓度太高：适当降低引物浓度。

（C）cDNA 模板带有基因组污染：重新制备 cDNA 模板。

（d）CT 值≥ 30 易出现非特异扩增。

阴性对照出现明显扩增

(a)反应体系污染

更换新的 Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

(b)扩增为引物二聚体引起

配合融解曲线进行分析。

CT值出现太晚

(a)扩增效率极低

优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。

（b）模板浓度太低

减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

(c)模板降解

重新制备模板，重复实验。

(d)PCR 产物太长

推荐 PCR 产物长度为 80 bp-150 bp。

（e）体系中存在 PCR 抑制剂

重新制备模板，重复实验。

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荧光定量 PCR

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逆转录反应

总 RNA 提取 - 酚氯仿抽提法

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