实时荧光定量PCR应用及结果分析--相对定量和绝对定量

第三章：实时荧光定量 PCR 的应用

一、相对定量

测定不同样品中基因表达量的相对值。

内参基因的选择

(1)始终选择表达充沛、均一的基因做为内参基因；

(2)不要盲目选择常用的内参基因；

(3)常用内参基因：GAPDH，Actin，Tublin。

内参基因的选择至关重要，决定结果的有效性

加入内参基因后：

结果计算

二、绝对定量

根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值 ( 拷贝数 )。

标准品：具有明确拷贝数浓度的样品

A/ 克隆质粒 B/ PCR 产物 C/ cDNA ( 扩增效率测定等用途可以使用，绝对定量不能使用 )

拷贝数计算

平均分子量（MW）:

dsDNA=( 碱基数 ) x (660 道尔顿 / 碱基 )

ssDNA=( 碱基数 ) x (330 道尔顿 / 碱基 )

ssRNA=( 碱基数 ) x (340 道尔顿 / 碱基 )

拷贝数计算公式 : (6.02 x 1023 拷贝数 / 摩尔 ) x ( 浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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