分子克隆实验解决方案-第一章：分子克隆实验概述

分子克隆技术是目前实验室常用的实验技术之一，研究者运用该技术能够将 DNA 片段以体外重组的方式构建至载体，研究者运用该技术能够将DNA片段以体外重组的方式构建至载体，随后通过转化操作导入合适的宿主中复制扩增，最后筛选得到满足实验需求的载体克隆。

一、 分子克隆实验方法

分子克隆研究一般需要将特定 DNA 片段插入至载体形成重组质粒。根据不同的实验目的，
将常见的分子克隆技术进行分类：
·入门克隆：TA 克隆、TOPO 克隆。
·定向克隆：同源重组、酶切连接（黏性末端双酶切反应）。
·定点突变：碱基的插入、缺失与改变。

1.酶切连接

酶切连接作为载体构建实验最标志性的技术，是利用限制性内切酶（特指 Type II型限制性内切酶）和 T4 DNA 连接酶，完成 DNA 片段 / 载体的重组连接。
限制性内切酶依据结构复杂程度、识别序列、切割位点位置及辅助因子要求分为四类，其中 Type II 型限制性内切酶可识别特异的双链 DNA 序列，切割位点位于识别序列内或临近识别序列，以内切的方式水解核苷酸链中的磷酸二酯键，生成特定 DNA 片段（5’ 端为磷酸基团，3’ 端为羟基）。

T4 DNA 连接酶可以催化相邻的 5’磷酸基团末端和 3’羟基末端，生成磷酸二酯键。

采用酶切连接的方法构建载体时，首先对载体和片段上酶切位点进行分析，因载体和片段需要用相同的限制性内切酶进行消化，因此在选择酶切位点时，需要选择载体上含有的特定酶切位点，而目的片段内部不含有该酶切位点（若插入片段内部含有该酶切位点，则在使用限制性内切酶消化插入片段时，会将片段内部切开）。通过 PCR 的方法在目的片段两端引入线性化载体对应的酶切位点，随后限制性内切酶对质粒 / 载体和扩增片段进行酶切消化，得到末端序列对应 / 一致的酶切产物并纯化，然后使用 T4 DNA 连接酶对纯化的酶切产物（片段与载体）进行连接，经过感受态细胞转化、筛选等操作，最终得到重组质粒。该方法在使用双酶切线性化时，可实现定向克隆，亦可变换所用载体；但有时会因难以找到适宜的酶切位点及组合，或限制性内切酶切割 DNA 效率低下，造成实验推进困难。

2. TA 克隆

TA 克隆是指把 PCR 片段与一个具有 3 ’-T 突出的载体进行连接，经过感受态细胞转化、筛选等操作得到重组质粒的技术。利用 Taq DNA 聚合酶非模板依赖的末端转移酶活性在双链 PCR 产物的 3’ 末端添加一个 A 碱基，与使用特殊方法处理的具有 3’-T 突出碱基的线性化载体，通过 T/A 配对及 T4 DNA 连接酶的作用进行连接。该方法快捷、高效，但不兼容平末端产物的连接，对于使用高保真酶扩增的平末端产物需要额外进行加A反应。

3. TOPO 克隆

TOPO 克隆是指利用拓扑异构酶的催化作用，完成目的片段与线性载体连接，经过感受态细胞转化、筛选等操作得到重组质粒的技术方法。拓扑异构酶的核心酶是 DNA 拓扑异构酶I，具有以下几大特点：
① 同时具有限制性内切酶和连接酶的功能；
② 80% 的连接反应在 2min 内完成 ;
③ 不需要外界提供能量。
因此，拓扑异构酶可以切割一条 DNA 链并与 3’ 端 T 的磷酸基团形成共价键，使 DNA解旋。随后，通过线性化 DNA 片段的 5’ 端羟基进攻形成共价键，该酶从 DNA 上释放出来。

为了利用拓扑异构酶的这一连接活性，载体首先利用 TOPO 酶线性化处理制备线性TOPO 载体，随后加入 DNA 片段完成重组连接。据此，TOPO 实验的基本原理可简单理
解为：
① PCR 产物（目的基因）末端的 5 ’-OH 去进攻载体 DNA 和 TOPO 酶之间的磷酸键；

② TOPO 酶分子被释放出来，载体与目的基因形成具有双切刻的环形重组分子

4. 同源重组

同源重组是指利用重组酶将有末端序列且末端序列一致的两段序列进行重组，形成环形双链 DNA, 经过感受态细胞转化、筛选等操作得到重组质粒的技术方法。
 因此在该系统中，需要预先创建同源区域，通过将扩增插入片段的正向和反向 PCR 引物 5’ 端外延 15-20bp 碱基，使这些碱基与线性化质粒载体的末端序列全部匹配，这样扩增出的插入片段两端就与线性载体末端序列同源。随后 Vazyme 的 ClonExpress 同源重组系列核心酶 Exnase，识别这部分同源序列并发挥重组功能。该方法快速、高效，不依赖酶切和连接，不限制目标载体和酶切位点选择，极易实现定向克隆。

5. 定点突变

定点突变是指利用 PCR 等方法向目的 DNA 片段（此处特指质粒）引入需要的碱基变化，包括碱基的插入、缺失与改变。传统定点突变系统利用一对反向互补的引物对质粒 PCR 扩增并退火成环，突变位点位于引物中间，PCR 扩增为非指数扩增，存在模板需求量大、DpnI 消化部分导致的假阳性问题。

MutExpress（Vazyme）点突变系统基于 ClonExpress 快速克隆技术，利用一对部分反向互补的引物对质粒 PCR 扩增，使用重组酶针对同源区域重组成环。突变位点位于
引物的反向互补区域，PCR 扩增为指数扩增，模板需求量少，DpnI 可以全部消化，具有超高成功率，使得该系统成为快速、高效改变所需碱基变化的强力选择。

DpnI 消化原始模板质粒的原理为：DpnI 特异识别模板 GATC 序列，只有当 A 碱基被甲基化时，DpnI 才能进行切割。从克隆用化学感受态细胞（DH5α、Fast-T1 等，非甲基化酶缺陷型）提取出的原始质粒，可被 DpnI 切割消化；PCR 扩增产物不含甲基化修饰，不会被 DpnI 消化。

二、分子克隆实验方法的选择

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兼容平末端产物的连接，对于使用高保真酶扩增的平末端产物需要额外进行加 A 反应。困难。