分子克隆实验的流程及注意事项--一、酶切连接

一、酶切连接
一般来说，限制性内切酶的选择非常重要。建议从以下方面判断选择：
1.限制性内切酶的识别序列在目的载体中存在且只有一个，在目的片段中不存在；
2.尽量选择酶切产物为粘性末端、酶切效率高的限制性内切酶，如BamH I、Hind III 等；
3.双酶切时，注意缓冲液对两种内切酶的活性影响，可根据具体活性相应调整酶量和反应时间；若缓冲液不能同时满足两种酶的要求，需要分步酶切；
4.单酶切时，建议对线性化载体进行去磷酸化操作，减少载体自身环化的出现。
注： 酶 切 后， 为 防 止 载 体 自 连 ， 尤 其 当 酶 切 后 产 物 末 端 可 互 补 或 是 平 端 时 （ 产 物 末 端 的 磷 酸 基团 和 羟 基 基 团 可 连 接 成 为 酯 键 导 致 自 连 发 生 ）， 有必要进行载体的去磷酸化 。在载体去磷酸化过程中，碱性磷酸酶可去除载体末端的5’磷酸基团 。

引物设计与PCR扩增

1.完成目的片段 PCR 扩增引物设计后，根据载体线性化使用的限制性内切酶，分别在上下游引物的 5’端引入对应内切酶的酶切位点与保护碱基；

2.建议使用高保真酶进行目的片段的 PCR 扩增，并摸索退火温度，优化反应体系和程序。

PCR / 酶切产物的纯化回收

PCR/ 酶切反应后，产物应当进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，判断是否存在目的大小的条带；
2.推荐使用切胶回收的方式纯化回收 ( 切胶时间最好控制在 3min 内，避免紫外照射对 DNA 的损伤 )，回收浓度使用 NanoDrop/OneDrop 等仪器检测，并跑胶鉴定是否仅存在目的条带；
3.回收浓度低时，可通过增加 PCR/ 酶切反应体系，采取多管反应单管回收的方式，提高回收产物的浓度；
4.PCR 产物应当在完成切胶回收操作后，再进行酶切反应及后续的纯化回收。

目的片段与载体的连接

利用 T4 DNA 连接酶完成酶切后载体与片段的连接重组。
1. 连接体系中使用的线性化载体与目的片段摩尔比可在 1:1 ~ 1:10 之间调整，一般最适比例为 1:3；
2. 平末端载体与 DNA 片段连接时，应首先将载体进行去磷酸化操作，减少载体自身环化的出现；
3. 连接体系各组分投入体积≥ 1μl，浓度过高时可稀释后使用。

感受态转化涂板
1.连接产物转化的感受态细胞建议使用克隆用化学感受态细胞，不建议使用表达用感受态细胞；
注：DH5α、Fast-T1 适合≤ 15kb 质粒转化；XL10 适合 >10kb 质粒转化
2.重组产物体积与感受态细胞体积的比例为 1:10，推荐 10μl 重组产物加入至 100μl 感受态细胞或 5μl 重组产物加入至 50μl 感受态细胞；
3.热激时间：按照感受态细胞说明书操作进行；
4.平板抗生素抗性：平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致；
5.菌液涂板体积：将菌液离心（2500×g、3min），移液枪吸取丢弃多余 LB 培养基，保留
100μl 重悬后全部涂板；或吸取合适体积涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1.挑取平板中体积大小适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的单克隆菌落；

2.挑取数个单克隆菌落进行鉴定分析；
3. 挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混匀后，吸取 1-2μl 作为
PCR 反应（10/20μl 体系）模板；
4. 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行 PCR 鉴定。

常见问题分析

未酶切或部分酶切

1. 限制性内切酶失活：建议使用新酶；

2. 反应体系与程序非最佳化：按照说明书建议操作；

3. 限制性内切酶浓度过低：建议增加酶使用量；

4. DNA 模板过多：按照说明书建议操作；

5. 体系存在抑制剂：对照组操作验证；

6. 识别位点错误：测序验证序列信息；

7. DNA 可能形成超螺旋结构：增加酶量；

8. 识别位点过于接近 DNA 末端：末端添加保护碱基。

安培生物致力成为推动生命科学进步值得信赖的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东，服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，旨在为生命科学的发展提供较好的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线，在各个领域内向用户提供较高的水平和质量稳定的产品，安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等客户提供各种产品、技术支持与服务。可以在第一时间为用户提供比较先进的专业资讯和完备的产品和物流服务。 专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持，深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴，安培生物非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。作为专业性的产品供应商，公司出资存备了大量现货，配合优秀的销售队伍以及专业的技术支持，随时为客户提供服务