分子克隆实验的流程及注意事项--二、TOPO克隆

2. 建议使用高保真酶进行目的片段的 PCR 扩增，并摸索退火温度，优化反应体系和程序。

PCR产物的纯化回收
1.PCR 反应后，产物应当进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，判断是否存在目的大小的条带；

2.推荐使用切胶回收的方式纯化 ( 切胶时间最好控制在 3min 内，避免紫外照射对 DNA 的损伤 )，回收浓度使用 NanoDrop/OneDrop 等仪器检测，浓度应当≥ 30ng/μl，并跑胶鉴定是否仅存在目的条带；

目的片段连接至载体

1.连接反应体系按照说明书要求投入，各组分投入体积≥ 1μl，若浓度过高可稀释后使用；

2.连接反应温度可尝试 25°C或 37°C，时间 5min，若不长克隆或克隆空载体 / 假阳性，时间可尝试延长至 30min；

感受态转化涂板

1.连接产物转化的感受态细胞选择使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化学感受态细胞；

2.感受态细胞不可反复冻融使用，-80°C取出后建议一次用完；

3.重组产物体积与感受态细胞体积的比例为 1:10，推荐 10μl 重组产物加入至 100μl 感受态细胞或 5μl 重组产物加入至 50μl 感受态细胞；

4.热激时间：按照感受态细胞说明书操作进行；

5.平板抗生素抗性：平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致；

6.菌液涂板体积：将菌液离心（2500×g，3min），移液枪吸取丢弃多余 LB 培养基，保留100μl 重悬后全部涂板；或吸取合适体积涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1.挑取平板中体积大小适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的单克隆菌落；

2.挑取数个单克隆菌落进行鉴定分析；

3.挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混匀后，吸取 1-2μl 作为PCR 反应（10/20μl 体系）模板；

4.推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行 PCR 鉴定。