分子克隆实验的流程及注意事项--三、同源重组

2.建议使用高保真酶进行目的片段的 PCR 扩增，并摸索退火温度，优化反应体系和程序。

载体线性化

1.双酶切：同时选择两种限制性内切酶对载体质粒进行线性化处理。内切酶选择可参考第二章第一节内容；

3.反向 PCR 扩增：以载体质粒为模板，以 PCR 扩增形式进行线性化。建议使用高保真酶扩增，降低突变引入，且模板质粒投入量不宜过多（50μl 投入 1ng），并使用 DpnI 对扩增产物消化。

目的片段和线性化载体的纯化回收

2.推荐使用切胶回收的方式纯化（切胶时间最好控制在 3min 内，避免紫外照射对 DNA 的伤），回收浓度使用 NanoDrop/OneDrop 等仪器检测，浓度应当≥ 20ng/μl，并跑胶鉴定是否为单一目的条带；

3.回收浓度低时，可通过增加 PCR/ 酶切反应体系，采取多管反应单管回收的方式，提高回收产物的浓度。

目的片段与线性化载体连接重组

1.连接反应体系按照说明书要求计算投入量，体系中各组分投入体积≥ 1μl，若浓度过高可稀释后使用；

感受态转化涂板

连接产物转化的感受态细胞选择使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化学感受态细胞；
2. 感受态细胞不可反复冻融使用，-80°C取出后建议一次用完；
3. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例为 1:10，推荐 10μl 重组产物加入至 100μl 感受态
细胞或 5μl 重组产物加入至 50μl 感受态细胞；
4. 热激时间：按照感受态细胞说明书操作进行；
5. 平板抗生素抗性：平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致；
6. 菌液涂板体积：将菌液离心（2500×g、3min），移液枪吸取丢弃多余 LB 培养基，保留
100μl 重悬后全部涂板；或吸取合适体积涂板。

单克隆菌落PCR鉴定
1. 挑取平板中体积大小适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的单克隆菌落；
2. 挑取数个单克隆菌落进行鉴定分析；
3. 挑取的菌落放入已添加 10μl ddH 2 O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混匀后，吸取 1-2μl 作为
PCR 反应（10/20μl 体系）模板；

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行 PCR 鉴定。

常见问题分析：
不长克隆
1. 引物同源臂设计错误：长度（不计算酶切位点）应为 15-20bp 之间，过长过短均影响重组效率；GC 含量以 40-60% 之间最适，超出范围会影响重组效率。建议使用 CE Design 在线设计；
2. 重组反应体系不符合要求：片段和线性化载体的总长度不应超过 20kb，应当切胶回收且回收浓度不低于 20ng/μl；浓度过高时需稀释使用，保证体系投入体积不小于 1μl；投入量按
照下表公式计算：

3. 连接反应不适当：反应应在 PCR 仪中进行，温度、时间设置按照说明书进行，当同源臂GC 含量超过 60% 或连接片段数较多时，可延长至 30min，其中 C112/C113 可将温度时间改为 50°C 15min；
4. 阳性对照反应：使用试剂盒中提供的线性化载体和插入片段，按说明书配制重组反应体系，以排除其他实验材料及操作因素的影响；
5. 转化涂板操作不当：感受态细胞应选用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化学感受态细胞，不可使用电击感受态细胞；重组产物体积与感受态体积的比例为 1:10；热激时间按照感受态细胞说明书操作；平板使用抗性与载体抗性保持一致；涂板前将菌液离心（2500×g，3min），移液枪吸取丢弃多余 LB 培养基，保留100μl 重悬后全部涂板。

假阳性；

引物同源臂设计错误：长度（不计算酶切位点）应为 15-20bp 之间，过长过短均影响重组效率；
GC 含量以 40-60% 之间最适，超出范围影响重组效率。建议使用 CE Design 在线设计；
2. 目的片段 PCR 扩增模板质粒残留：若目的片段扩增自质粒模板，且质粒抗性与载体抗性一致时，应当降低质粒模板投入量（50μl 体系使用 1ng 质粒），扩增后使用 DpnI 消化并切胶回收；
3. 线性化载体产物原始质粒残留：若使用酶切方式线性化载体，使用跑胶鉴定部分酶切（酶切前后质粒同时对比），部分酶切时需调整酶切方案（参考第二章第一节内容），酶切产物应切胶回收；若通过 PCR 反向扩增线性化载体，应当降低质粒模板投入量（50μl 体系使用 1ng 质粒），扩增后使用 DpnI 消化并切胶回收；
4. 重组反应体系不符合要求：片段和线性化载体的总长度不应超过 20kb，应当切胶回收且回收浓度不低于 20ng/μl；浓度过高时需稀释使用，保证体系投入体积不小于 1μl；投入量按照下表公式计算。

测序突变

5. 平板抗性失效：平板使用抗性与载体抗性保持一致，并确认抗生素工作液浓度和有效期（一测序突变1.测序克隆数过少：测序克隆数只有 1 个时，测序信息部分可信，建议多测几个单克隆，检查突变处的测序信号是否有问题，分析突变是否从模板引入；
2. 突变位置：若碱基突变位于引物处，建议重新合成引物再次实验；位于其他部位的突变，应当使用高保真酶重新制备模板再次实验。

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