从原理到实操，虾青素抗肝纤维化实验流程！（2）

2 DMN（二甲基亚硝胺）诱导C57小鼠肝纤维化模型建立

2.1 原理  

二甲基亚硝胺（DMN）通过肝脏代谢生成甲基自由基，直接损伤肝细胞及肝窦内皮细胞，激活炎症反应（TNF-α、IL-6释放）和肝星状细胞（HSC）活化，促进胶原蛋白（Ⅰ/Ⅲ型）异常沉积，最终形成肝纤维化。其机制不依赖致癌性基因突变，而通过氧化应激与ECM代谢失衡驱动纤维化进程。

2.2 实验步骤  

2.2.1 动物准备

• 品系选择：雄性C57BL/6J小鼠（6-8周龄），雄性对DMN肝毒性更敏感。

• 环境适应：SPF级环境中适应1周，自由摄食饮水，维持12小时光/暗周期。

2.2.2 DMN给药方案

纤维化诱导方案：

• 剂量：DMN 1mg/ml（溶于生理盐水，避光保存，现用现配）。  

• 注射方式：每日固定时间1次腹腔注射，每周隔天注射共3天，随后停药4天（每周为1个循环）。  

• 总周期：4周（共12次注射）。  

关键注意：

• 注射时避免漏液（易致腹膜炎症）。

• 每周监测体重，存活率需＞80%（剂量过高易致死）。  

2.2.3 实验周期

• 急性损伤期：注射后1-2周，肝细胞坏死与炎症浸润显著。

• 纤维化形成期：注射后3-4周，门静脉周围胶原沉积，桥接纤维间隔形成。

2.3 模型验证方法  

2.3.1 生化指标检测

• 血清肝功能：ALT、AST水平升高2-3倍（ELISA法）。

• 肝纤维化标志物：羟脯氨酸（Hyp）含量增加＞50%（比色法）。

2.3.2 病理学分析

1. 大体观察：肝脏表面粗糙，可见灰白色纤维条索（图1）。

2. 组织切片：

• H&E染色：肝细胞坏死、炎性细胞浸润及纤维间隔形成。

• 天狼星红染色：胶原沉积面积定量（红色区域占比≥15%）。

• 免疫组化：α-SMA（活化的HSC标志物）阳性率＞30%。

2.3.3 分子标志物检测

• Western blot：TGF-β、CollagenⅠ蛋白表达显著上调。

• qPCR：MMP-2/9下调，TIMP-1上调，提示ECM降解受阻。

总结

DMN通过氧化损伤→炎症→HSC活化→胶原沉积的级联反应诱导肝纤维化，模型稳定且重复性高，需结合多维度指标（生化、病理、分子）验证，适用于抗纤维化机制与药物研究

2.4 关键注意事项

2.4.1 剂量控制

DMN剂量>15 mg/kg可能导致急性肝坏死（图二），<5 mg/kg则肝损伤发生率低。

2.4.2 品系与性别差异

• C57BL/6J小鼠对DMN敏感性低于其他品系（如B6C3F1），需延长诱导周期。  

• 雌性小鼠因雌激素保护作用，肝纤维化发生率显著低于雄性。  

2.4.3 伦理与动物福利

• 每周监测体重、活动度及毛发状态。  

• 肝损伤体积>2000 mm³或体重下降≥20%时，使其优逝。

安培生物致力成为推动生命科学进步值得信赖的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东，服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，旨在为生命科学的发展提供较好的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线，在各个领域内向用户提供较高的水平和质量稳定的产品，安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等客户提供各种产品、技术支持与服务。可以在第一时间为用户提供比较先进的专业资讯和完备的产品和物流服务。 专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持，深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴，安培生物非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。作为专业性的产品供应商，公司出资存备了大量现货，配合优秀的销售队伍以及专业的技术支持，随时为客户提供服务