从原理到实操，虾青素抗肝纤维化实验流程！（4）

4 壳聚糖虾青素纳米颗粒对肝纤维化小鼠肝损伤生长的抑制

4.1 实验设计的科学依据

• 剂量选择：参考文献中虾青素有效剂量（10-60 mg/kg/d）及壳聚糖纳米递送系统的生物利用度优化结果。  

• 阳性对照：选用索拉非尼（5 mg/kg/d）验证壳聚糖虾青素纳米颗粒与传统化疗药物的效果差异。  

• 检测指标关联性：  

肝损伤体积/重量：直接评估抗肝损伤效果。  

凋亡相关蛋白（Bax/Bcl-2）：揭示诱导凋亡的分子机制。  

肝组织病理学：观察肝损伤坏死及正常组织损伤程度。

4.2 技术路线

肝纤维化模型建立 → 肝损伤增殖/氧化应激 → 壳聚糖虾青素纳米颗粒干预 → 抑制增殖/诱导凋亡 + 抗氧化抗炎 → 抑制肝损伤生长、改善肝功能。  

4.3 实验材料

• 耗材：1 mL无菌注射器、钝头灌胃针（20-22 G，3-4 cm）、无菌EP管、离心管。

• 试剂：壳聚糖虾青素纳米颗粒（粒径100-200 nm，Zeta电位+30 mV）、生理盐水、索拉非尼。  

• 设备：电子天平（0.1 mg精度）、微量移液器（10-1000 μL）、小动物活体成像系统、小鼠固定器。  

• 动物：C57BL/6J SPF级小鼠（6-8周龄）

• 实验周期：肝纤维化建模4周，干预治疗6周。

4.4 实验步骤

4.4.1 实验动物分组设计

分组原则：

• 对照全面性：涵盖正常肝组织、肝纤维化模型、干预梯度及阳性对照。  

• 逻辑递进性：从基础对照到剂量效应，明确药物作用机制。  

具体分组（每组8-10只）：


4.4.2 药物配制

1. 纳米颗粒悬浮液制备步骤：

原料准备：

• 壳聚糖虾青素纳米颗粒冻干粉（无菌分装，避光保存于-20℃）。  

• 生理盐水（0.9% NaCl，灭菌处理）。

母液配制：

• 称取冻干粉，按 10 mg/mL 浓度加入生理盐水（例：50 mg冻干粉 + 5 mL生理盐水）。  

• 涡旋振荡：2000 rpm，持续10分钟，确保颗粒充分分散，避免聚集。  

• 超声处理（可选）：20 kHz超声探头，功率50 W，冰浴中超声3分钟（间歇脉冲，开2秒/关1秒），进一步分散纳米颗粒。  

2. 工作液稀释：

根据剂量需求稀释至目标浓度（如10 mg/kg或50 mg/kg，此处的目标浓度是指按照正常成年人（60kg）所需剂量换算成小鼠的给药量），现用现配，避光保存（4℃≤24 h）。  

示例：  目标剂量 10 mg/kg（小鼠体重25 g）：  

• 灌胃体积通常为 0.1 mL/10 g（即0.25 mL/25 g）。  

• 所需浓度 = 剂量（10 mg/kg） × 体重（0.025 kg） / 灌胃体积（0.25 mL） = 1 mg/mL。  

• 取母液（10 mg/mL）与生理盐水按 1:9 比例稀释（如1 mL母液 + 9 mL盐水）；

• 50 mg/kg（此处的目标浓度是指按照正常成年人（60kg）所需剂量换算成小鼠的给药量）所需浓度同上。

3. 质量控制：

粒径＜200 nm，Zeta电位＞+30 mV，无菌过滤（0.22 μm）。  

4. 保存：

• 现配现用，避光4℃保存≤24 h。  

• 防聚集：充分涡旋/超声，避免静置。

• 稳定性：pH 5.5-6.0（可加0.1%醋酸）。

• 毒性控制：测试空白载体，浓度＜2%。

4.4.3 灌胃操作关键步骤：

1.灌胃前准备：

• 禁食4小时（不禁水），减少胃内容物干扰。  

• 使用钝头灌胃针（直径1.5 mm），灌胃体积以0.1 mL/10 g体重为依据，每天固定时间持续灌胃，阳性药是根据正常成年人日口服推荐量和小鼠体重进行等量换算。  

2.固定与进针：

• 抓取小鼠颈背部，头部后仰30°，沿口腔右侧缓慢插入灌胃针（深度3-3.5 cm）。  
  

• 遇阻力时退出调整角度，避免刺伤食道（见以下图示）。  
  
  

3.推注与观察：

• 匀速推注（0.05 mL/s），观察小鼠无呛咳后退出针头。  

• 记录灌胃时间、剂量及不良反应（如腹泻、呼吸困难）。  

4.4.4 C57肝纤维化检测指标

1. 组织病理

• 染色：Masson（胶原蓝染）、天狼星红（胶原定量）  

• 评分：Ishak或METAVIR系统  

• 标志物：α-SMA（活化的星状细胞）  

2. 血清指标

• 损伤：ALT、AST  

• 纤维化：HA（透明质酸）、PCIII（III型前胶原肽）  

3. 分子检测

• 基因：Col1a1、TGF-β1（qPCR）  
  

• 蛋白：Collagen I、α-SMA（Western Blot）  

4. 功能指标

• 羟脯氨酸：定量肝胶原含量（金标准）

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