分子克隆实验的流程及注意事项--四、定点突变

四、定点突变

定点突变引物设计与PCR扩 增
1. 引物设计要求：5’- 15-21bp 反向互补区域 + 至少 15bp 非互补区域 -3’，反向互补区域 GC含量 40%-60%，待突变位点至引物 3 ’ 端 Tm 值 >60°C。根据实验需求选择对应模块进行引物设计；
2. 建议使用试剂盒搭配的扩增模块进行 PCR 扩增，并摸索退火温度，优化反应体系和程序；
3. PCR 扩增体系的模板质粒投入量推荐 50 μl 体系投入 1 ng，扩增循环数应当≤ 35 个。

扩增产物DpnI消化和纯化回收

1.取 5μl 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，判断是否存在目的大小的条带后，剩余产物使用 DpnI 消化（45μl 扩增产物加入 1 μl DpnI，轻轻吸打混匀后，在 PCR 仪中 37°C反应 1-2 h消化质粒模板，再 70°C反应 15 min 使 DpnI 失活）；
2. 推荐使用切胶回收的方式纯化（切胶时间最好控制在 3 min 内，避免紫外照射对 DNA 的损伤），回收浓度使用 NanoDrop/OneDrop 等仪器检测，浓度应≥ 20ng/μl，并跑胶鉴定回收产物是否为单一目的条带；

3. 回收浓度低时，可通过增加反应体系，采取多管反应单管回收的方式，提高回收产物的浓度。

重组反应

1.连接反应体系按照说明书要求计算投入量，体系中各组分投入体积≥ 1μl，若浓度过高可稀释后使用；
2.连接反应程序按照说明书要求进行，建议在 PCR 仪中反应。

感受态转化

1. 连接产物转化的感受态细胞选择使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化学感受态细胞；
2. 感受态细胞不可反复冻融使用，-80°C取出后建议一次用完；
3. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例为 1:10，推荐 10μl 重组产物加入至 100μl 感受态细胞或 5μl 重组产物加入至 50μl 感受态细胞；
4. 热激时间：按照感受态细胞说明书操作进行；
5. 平板抗生素抗性：平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致；
6. 菌液涂板体积：将菌液离心（2500×g，3min），移液枪吸取丢弃多余 LB 培养基，保留100μl 重悬后全部涂板；或吸取合适体积涂板。

常见问题分析：

质粒模板无法正常扩增
1. 引物设计错误：反向互补区域长度应为 15-21bp 之间，过长过短均影响重组效率；GC 含量以 40-60% 之间最适，超出范围影响重组效率。建议使用 CE Design 在线设计；
2. 质粒模板质量差：凝胶电泳检测质粒模板，若出现开环、线性条带、拖尾等条带，说明模板质量差，需重新制备；
3. PCR 反应体系 / 程序设置不当：质粒模板投入量过多会抑制 PCR 反应，建议 50μl 体系投入 1ng；基于上下游引物 Tm 值，设定适宜范围进行梯度摸索；质粒长度超过 8kb 时，可尝试变更为双 / 多点突变策略，分段扩增。

公式计算投入量；浓度过高时需稀释使用，保证体系投入体积不小于 1μl。