分子克隆实验---第三章：测序结果解读-雷竞技RAYBET最新版

技术文章ARTICLE

您当前的位置：首页 > 技术文章 > 分子克隆实验---第三章：测序结果解读

分子克隆实验---第三章：测序结果解读

发布时间： 2025-03-31　　点击次数： 110次

一代测序是克隆实验中常见的下游实验。现代 DNA 测序技术源于 Sanger 链末端终止测序法，其工作原理与 Sanger 测序不同的是 4 组反应的双脱氧核苷酸分别用不同的荧光分子标记，每个试管的产物在光激发下发出不同颜色的荧光，延伸反应和链终止完成后，将全部 4 组反应物混合，在同一泳道进行凝胶电泳，通过激光束激发荧光分析不同位置碱基的荧光颜色完成测序分析。

一般情况下，测序信号文件多为 *.ab1 文件，该文件能够得到每个碱基的测序峰型及整体质量；*.seq 文件则为 ab1 文件导出得到的测序结果序列，ab1 文件中已具有碱基序列信息，因此 *.seq 文件可不作重点关注。

一代测序的每次测序反应能够产生约 600-900bp 碱基信息，测序开始的 5’ 端约 50bp 左右的测序信号不稳定，检测 800bp 左右之后信号开始衰减，各种波之间有重叠等情况。这部分结果信息不准确，不建议参考使用。

理想状态的测序信号应当是独立单一的峰形信号，波峰与波谷清晰，峰与峰之间的距离均匀，波峰底部没有杂峰干扰，此时得到的碱基信息可信度超高；测序信号出现双峰、套峰等情况时，该处碱基信息可信度低，需要其他测序结果共同比对分析

测序问题的主要原因：
◆ 套峰
a) 全双峰：多引物结合位点（菌液、质粒）；非特异扩增（PCR 产物）；
b) 前双峰：多引物结合位点，其中一套模板测序中断（菌液、质粒）；多引物结合位点（PCR
扩增未纯化产物）；引物二聚体或小片段干扰（PCR 产物纯化非切胶样品）；
c) 中间双峰：非单克隆（菌液、质粒）；碱基缺失或等位基因双模板（PCR 扩增未纯化产物）；
d) 后双峰：非单克隆（菌液、质粒）；碱基缺失（PCR 产物）。

◆ 测序信号
a) 无信号：引物结合位点不存在或被破坏；
b) 信号差：引物或模板的质量不高，或引物和模板匹配性低，或样本浓度偏低；
c) 信号衰减：可能因测序序列的特殊结构导致，如 Poly 结构、重复序列、回文结构、发卡结构、GC 富集、AT 富集等；若为正常峰形后逐渐衰减，可能模板反应量不足；
d) 信号中断：模板存在高级结构，导致 dNTP 和 ddNTP 在某位点无法与模板结合；
e) 测序移码：测序开端移码可能是引物降解，局部移码可能样本存在高级结构；
f) 测序底峰干扰：可能测序引物不纯；可能测序样品不纯混有正、反向引物。

优化方案：套峰
二聚体、小片段干扰：凝胶电泳，切胶纯化回收；
多引物结合位点：更换引物测序或反向测通；
碱基缺失：构建单克隆后测序；
非单克隆：在载体构建克隆正确下重新挑取单克隆测序；
非特异性扩增：优化反应条件重新制备；
等位基因双模板：构建单克隆后测序。

测序信号
无信号：更换引物或重新提供样品测序；
信号差：提供高质量样品测序；
信号衰减：特殊结构导致衰减，建议反向测序拼接；若正常峰形后逐渐衰减：提供高质量样品；
测序中断：建议反向测序测通；
测序底峰干扰：重新制备模板，引物 PAGE 胶纯化。

安培生物致力成为推动生命科学进步值得信赖的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东，服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，旨在为生命科学的发展提供较好的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线，在各个领域内向用户提供较高的水平和质量稳定的产品，安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等客户提供各种产品、技术支持与服务。可以在第一时间为用户提供比较先进的专业资讯和完备的产品和物流服务。专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持，深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴，安培生物非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。作为专业性的产品供应商，公司出资存备了大量现货，配合优秀的销售队伍以及专业的技术支持，随时为客户提供服务

下一篇：细胞死亡的三种方式以及俩种凋亡细胞的检测方法（Tunel、Annexin V）

上一篇：dota2雷竞技规则

产品中心 Products