细胞死亡的三种方式以及俩种凋亡细胞的检测方法（Tunel、Annexin V）

细胞死亡

动物细胞的死亡主要有三种方式：细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬。目前对动物细胞凋亡的特征、机制和生物学功能的研究较为深入。

细胞凋亡也被称为程序性细胞死亡  (programmed cell Death,  PCD)  。PCD 最初是发育生物学中提出的概念,  其含义是发育过程中发生的某 类细胞的大量死亡,而这种细胞死亡要求特定的基因表达。细胞凋亡的典型特征是DNA规律性断裂为 180-200bp整数倍的片段,并暴露出3'-OH 末端,  在琼脂糖凝胶电泳时呈现有规律的梯状条带。

细胞坏死是区别于细胞凋亡的另一种典型死亡方式。当细胞受到意外损伤。如物理、化学因素或严重的病理性刺激的情况下细胞坏死才会发生。 此时细胞内 ATP 浓度下降,  细胞质出现空泡,  细胞质膜受损,  细胞内含物,  包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段释放到胞外,   引起 周围组织的炎症反应。 与细胞凋亡不同,  细胞坏死过程中染色质不发生凝集 ,  也不产生有规律的 180-200 bp 的 DNA 降解片段,  而是被随机降 解,  琼脂糖凝胶电泳时呈现弥散性分布,  俗称 u 拖尾 n 现象。

细胞凋亡

凋亡过程模式图

1. 正常细胞 2.细胞凋亡的起始 3.凋亡中的细胞 4.凋亡小体被邻近吞噬细胞吞噬

细胞凋亡检测方式

细胞凋亡检测有很多途径和方式,  Annex in v 法早期凋亡检测,  线粒体膜通透性变化检测,  凋亡蛋白酶活力检测,  TUNEL检测,   DNA ladder 电泳检测等等。目前应用范围最大的是能够对早期凋亡进行检测的Annexin V法，和能够区分坏死和凋亡细胞并特异性标记出细胞凋亡的TUNEL法。

A Annex in V检测

检测原理：

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。这一改变被认为是特异性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。Annexin V是一类广泛分布于真核细胞胞浆内的钙离子依赖性的磷脂结合蛋白，分子量为35~36KDa，能与细胞凋亡过程中外翻到膜外的PS高亲和力特异性结合，被作为检测细胞凋亡早期的灵敏指标之一。

以经典方法 Annex in V-FIT C/PI 为例。 用标记了 FITC 的 Annex in V 作为荧光探针,  再结合核酸染料碘化丙啶 (prop idi um  lodi de, PI ),  利 用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生,  并对凋亡细胞进行分群。  原理如下 :

FITC 标记的 Annex in V保留了与 PS 的高亲和力,  Annex in  V-FIT C 染色可在凋亡早期就检测到外翻的 PS,  识别出凋亡的发生。PI 是一种 核酸染料,  pl 不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,  但可穿透膜损伤的细胞,  如晚期凋亡细胞或者坏死细胞的细胞膜并与其内的DNA结合，将细胞核染色，可用来区分早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞或坏死细胞。

方法优势:
Annex in V 法检测细胞凋亡主要有三大优势:

1）特异性标记早期凋亡细胞膜表面的PS，联用核染料，对凋亡细胞进行分群和定量

2）精确反应细胞群体的凋亡趋势

3）操作自由度高，发射波长不一致的情况下可兼容共染

数据展示

下图使用Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A211)进行凋亡检测。使用不同浓度的喜树碱（Camptothecin,CPT）诱导健康Jurket细胞（人T淋巴瘤细胞）凋亡，并同时做竞争封闭实验，证明Annexin V-FITC的染色特异性。

结果表明，Annexin V法可以对凋亡细胞进行分群（左下角细胞为未凋亡细胞，右上角为晚期凋亡细胞）并且可以对不同程度的凋亡进行区分

                                                      Annexin V-FITC/PI 染色检测不同程度凋亡

用喜树碱CPT诱导Jurkat细胞凋亡，诱导浓度分别为0、4、8、12、16uM，分别诱导4h后，参照产品说明书实验方案进行染色，用流式细胞仪检测结果如图，（A）0 uM.（B）4 uM.（C）8 uM.(D)12  uM.(E)16 uM.(F)竞争封闭实验，采用16uM CPT诱导Jurkat细胞4h后，参照说明书收集并洗涤细胞，于染色前加入无燃料标记的Annexin V蛋白孵育10min,再进行Annexin V-FITC/PI染色。无染料标记的Annexin V结合了细胞上的PS，再进行染色时，Annexin V-FITC无法结合PS，这说明了染色的特异性。

B TUNEL法

检测原理：

TUNEL 测定法是一种末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法。这一方法借助一种可观测的标记物，如荧光素，能对凋亡细胞的核DNA中产生的3’-OH末端进行原位标记。使用荧光显微镜即可进行观察。TUNEL法中，直接标记步骤少，操作简便，间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高，是目前检测细胞凋亡最为常用、最为普遍的检测方法之一。

TUNEL 根据标记物的不同，可以分为荧光法和显色法两种，荧光法需要使用荧光显微镜进行观察，主要显示的是细胞核的状态，显色法使用普通光学显微镜即可进行观察，更方便对组织细胞本身的情况进行观察。

方法优势：

1）特异性标记凋亡细胞，而不标记坏死细胞；

2）相对于Annexin V从细胞群体角度反映凋亡，TUNEL法更有利于观察组织、细胞的整体凋亡状态；

3）TUNEL法使用样本更广：石蜡切片、冰冻切片、贴壁细胞、悬浮细胞；

4）方法兼容度高，可以根据自身需求进行免疫组化、免疫荧光共染等操作；

数据展示

Hela细胞爬片（共染GAPDH）

使用DNase I 室温处理10min后进行TUNEL染色

使用产品：TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A113)

A:DAPI B:TUNEL染色，标记凋亡细胞 C：GAPDH D：Merge

                                                           小鼠肝脏石蜡切片

使用产品：TUNEL Colorimetric Apoptosis Assay Kit(Vazyme #A114)进行染色

凋亡系列产品选购指南

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